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本制品是2×实时定量PCR扩增的预混溶液，具有荧光强度高，灵敏度高和特异性强，扩增产量高等特点。核心组分Hiper Spec Taq DNA聚合酶采用抗体法热启动，可以有效抑制样品准备过程中引物退火导致的非特异性扩增。同时配方添加了提升PCR反应扩增效率因子和均衡不同GC含量(30～70%)基因扩增的促进因子，使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。该产品利用不同染料的混合变色反应来监控移液操作，有效降低了移液误差的发生。

组分	1mL	5mL
2×Hiper Spec SYBR qPCR Mix	1mL	5×1mL
10×Dilution Buffer	1mL	1mL

保存：-20℃，有效期1年。

• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  
• 解冻后MasterMix可能出现絮状或白色沉淀，手握缓慢溶解并上下轻柔颠倒混匀至溶液澄清，不影响试剂性能。
  
• 使用前请上下颠倒以混匀MasterMix，请勿vortex避免产生气泡，影响定量结果。MasterMix经混匀短暂离心后即可使用。加样过程中吹打要轻，如果操作不慎MasterMix起泡，需再次离心方可使用。
  
• 由于本制品检测灵敏度极高，易被空气中气溶胶污染。因此反应体系配制时请于超净工作台内进行，配制过程中请使用灭菌枪头、反应管，条件容许的实验室推荐使用专用的移液枪和带滤芯的枪头。
  
• 推荐使用第一链cDNA合成试剂盒(用于qPCR)，以有效去除RNA样品中残留的基因组。
  
• 本制品仅作科研用途。

本制品中不包含用以校正孔与孔之间荧光信号误差的ROXReferenceDye，适用于以下荧光定量PCR仪：
Bio-RadCFX96,CFX384,iCycler iQ,iQ5,MyiQ;MiniOpticon,Opticon,Opticon 2,Chromo4;Cepheid SmartCycler;Eppendorf Mastercycler ep realplex,realplex 2 s;Illumina EcoqPCR;Qiagen/Corbett Rotor-GeneQ,Rotor-Gene3000,Rotor-Gene 6000;Roche Applied Science LightCycler 480;Thermo Scientific PikoReal Cycler;及其他不需要添加ROX ReferenceDye的荧光定量PCR仪。

• 推荐引物长度25bp左右。扩增产物长度150bp为佳，可以在100bp～300bp内选择。
  
• 正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超过2℃。引物Tm值60℃～65℃为佳。
  
• 引物碱基分布均匀，避免出现连续的4个相同碱基，GC含量控制在50%左右。3'端最后一个碱基最好为G或C。
  
• 引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有3个碱基以上的互补序列。
  
• 引物特异性需要用NCBIBLAST程序进行核对。避免引物3’端有2个碱基以上的非特异性互补。
  
• 设计完成的引物需要进行扩增效率的检测，只有具备相同扩增效率的引物才可用于定量比较分析。

• 2×Hiper Spec SYBR qPCR Mix中包含蓝色染料，10×Dilution Buffer为专用黄色浓缩模板稀释液。使用过程中，如需要进行模板示踪，则需稀释到1×作为模板稀释液使用，然后进行qPCR检测；如不需要进行模板示踪，则不使用Dilution Buffer即可。
  

  模板类型	10×Dilution Buffer使用方式	终浓度
  cDNA溶液、已溶解的质粒、基因组	若要稀释模板，则先使用无菌超纯水将模板稀释至目标浓度，后在每9μL模板中加入1μL 10×Dilution Buffer。	1×
  未溶解的DNA粉末	使用无菌超纯水将10×Dilution Buffer稀释至1×，使用合适体积的1×Dilution Buffer作溶剂溶解对应的DNA粉末。	1×

  • 实际使用过程中也可按需使用其他方案，保证最终模板中Dilution Buffer浓度为1×即可。
• 推荐qPCR反应体系：
  

  成分	50μL反应体系	20μL反应体系	终浓度
  2×Hiper Spec SYBR qPCR Mix	25μL	10μL	1×
  Forward Primer(10μM)	1μL	0.4μL	0.2μM
  Reverse Primer(10μM)	1μL	0.4μL	0.2μM
  模板DNA/cDNA	x	y	－
  无菌超纯水	至50μL	至20μL	－

  
  
  • 通常引物终浓度为0.2μM，也可以根据情况在0.1～1.0μM之间进行调整。
    
  • 如模板为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10，最佳模板加入量以保证扩增得到的Ct值在20～30个循环为宜。
    
  • 推荐使用20μL或50μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性；上机前需充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。
• 反应程序：
  

  步骤	温度	时间	循环数
  预变性	95℃	2min	1
  变性	95℃	10sec	40
  退火/延伸	60℃	30sec

  • 退火温度和时间：请根据引物TM值和目的基因的长度进行调整。
    
  • 荧光信号采集：请勿忘记打开荧光信号采集，按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置。
    
  • 熔解曲线：通常情况下可以使用仪器默认程序。

相关搜索：染料法qPCR预混液，2×Hiper Spec SYBR qPCR Mix